流式细胞术ppt课件

发布于:2021-09-17 00:18:10

流式细胞术 内容 一、流式细胞术工作原理 二、荧光染料选择 三、抗体选择 四、样品制备及对照设置 五、数据分析处理 六、流式细胞术的应用 一、流式细胞术工作原理 (一)流式细胞术的概念 流式细胞术(FCM,Flow Cytomytry)指利用流式 细胞仪 (Flow Cytomyter) 对处于快速流动的荧光染色的 细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选 (纯度可达99%以上)的技术。凡是能被荧光素标记的 且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的 细胞或颗粒,都可用流式细胞仪检测。 特点: 1、测量速度快,每秒钟测数千至上万个细胞; 2、可进行多参数测量; 3、可把指定特征的细胞分离出来(分选技术)。 美国B-D公司 型号:FACS Calibur (二)、流式细胞仪工作示意 喷嘴 鞘液 荧光信号 激光 (三)、流式细胞仪光信号 1、散射光信号:FSC和SSC ?前向散射光信号(FSC):与激光束方向同轴的称前向散 射光信号,反映细胞大小,细胞越大,前向散射光信号 越强;FSC信号与细胞的折射率有关,可用于表示细胞 的凋亡,区分死/活细胞时,可用于设门。 ?侧向散射光信号(SSC):与激光束方向垂直的称为侧向 散射光信号,主要反映了细胞的内部结构,内部结构越 复杂,SSC信号越强,反映细胞内颗粒性。 1、散射光信号 外周全血细胞(红细胞溶解后) ,FSC和SSC。 中性粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 2、荧光信号 ? 荧光素与特异抗体结合(荧光抗体)或荧光素; ? 荧光素吸收激光(激发光波长)能量; ? 荧光素释放光量子(发射光波长); ? 荧光抗体与细胞抗原结合越多,荧光信号越强; ? 荧光素与细胞核酸结合,荧光强度(FL)反映核酸含量; ? 荧光强度可区分荧光标记细胞与无荧光标记细胞,也 可区分高FL细胞与低FL细胞。 ? 一般的流式细胞仪装有一个激光光源(488nm),可 测出三个FL,即FL1、FL2、FL3,大型的流式细胞仪 装有三个激光光源(488nm、633nm和407nm),可测 出13个FL。 2、荧光信号 双色直接染色 二、荧光染料的选择 选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料; 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长; 3、使用多种荧光染料时,要考虑荧光染料之间的干扰。 PE-Cy5与APC干扰。 二、荧光染料的选择 488nm激光激发的染料: FITC:异硫氰酸荧光素,绿色,513nm PE:藻红素,橙黄色 575nm,信号最强 PerCP :多甲藻黄素-叶绿素蛋白,深红色,675nm PE-Cy5 (PC5) :670nm PE-Cy5.5 (PC5.5):667nm PE-Cy7 (PC7) :767nm PI (碘化丙啶):617nm 633nm激光激发的染料: APC:异藻蓝蛋白,红色 660nm 二、荧光染料的选择 非特异性荧光来源: ?自发荧光 检测自发荧光水*高的细胞时,使用发射光波长较长的 荧光染料(如APC),可以得到较好的S/N比 值。 自发荧光不太高的细胞,荧光抗体选择范围大。 ?非特异结合 有些荧光标记抗体表现出低水*的非特异结合,会造 成阴性细胞的荧光水*升高。 如(Cy3、Cy5和Cy5.5)和Texas Red标记的抗体,以 及某些复合染料如ECD,与某些细胞结合力增强。 二、荧光染料的选择 颜色补偿 ?荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围;检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测,从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ? 单标管用于调补偿。 Fluorescein (FITC) Excitation 300 nm 400 nm 400 nm Wavelength Emisson 600 nm 600 nm 500 nm 500 nm 700 nm 700 nm Protein Phycoerytherin (PE) Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Protein FITC和PE荧光光谱 补偿模型图 补偿调节前后对比 二、荧光染料的选择 1.细胞表型分析 双色分析:FITC与PE 三色分析:双色分析+PE-CY5或 PerCP-CY5.5。 四色分析:三色分析+APC或PE-CY5。 2.胞内蛋白与周期的关系分析 蛋白标记:FITC或GFP,DNA标记:PI 3.凋亡与坏死分析: 凋亡用Annexin V-FITC,坏死用PI。 三、抗体选择 选择商业化的流式用单克隆抗体,此类抗体非特异荧 光弱。最好用直标抗体。 四、样品制备及对照设置 样本来源: 1、单细胞:外周血,细针穿刺,洗脱液等; 2、组织:骨髓,肝,脾,淋巴结等; 3、培养细胞: 4、液体:血清、血浆、培养上清、细胞裂解液。 评价样品制备优劣的指标: 1、细胞的密度高于1×106/ml ; 2、非特异荧光,不超过1%; 3、无细胞碎片和聚集体,不能出现肉眼可见的团块。 四、样品制备及对照设置 细胞荧光有非特异性和特异性,实验结果有偶然性。 设置对照至关重要。 ? ? ? ? ? ? 空白管:未染色细胞,调电压 单染对照:单荧光素染色,调补偿 同型对照:同型抗体,去除非特异性染色 阴性对照:出现阴性结果 阳性对照:出现阳性结果 对照管和实验管:不加刺激因素和加刺激因素 样品染色影响因素:体积,温度,时间。 直接染色 间接染色 样品制备过程中常见的问题及解决对策 常见问题 细胞密度低 非特异荧光 强 碎片多 细胞聚集 原 因 解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特 异荧光 细胞生长好、避免反复吹打 彻底消化 细胞损失 抗体不纯、

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